T细胞是机体对抗感染与肿瘤的核心免疫力量。T细胞受体（TCR）与靶细胞表面肽-MHC复合物（pMHC）的特异性识别是T细胞发挥功能的基础，而TCR的功能亲和力（potency）——即TCR在生理条件下启动T细胞应答的能力——进一步决定了T细胞的体内命运与分化表型。因此，系统性地将TCR的抗原特异性、功能亲和力与表型状态相关联，对于理解免疫应答机制和优化免疫治疗策略至关重要。然而，现有技术均存在难以兼顾的局限。pMHC多聚体染色依赖已知抗原表位，且结合亲和力难以准确预测功能结局；基于体外共培养的功能筛选虽能绕过预设表位的限制，却因长时间培养而丢失T细胞的原始表型信息。近年来兴起的邻近标记策略试图在保留原位表型的同时捕获抗原特异性T细胞，但现有方案受限于“猎物”细胞（prey cell）表面底物表达的异质性和免疫突触以外的非特异性标记，灵敏度仍不足以区分TCR亲和力差异。如何在保留天然表型的前提下，高通量地同时解析抗原特异性、量化功能亲和力和保留内源表型状态，是领域内亟待解决的关键问题。
近日，清华大学免疫所徐萌与北京大学陈鹏团队合作，在Journal of Experimental Medicine（JEM）上发表了题为 PRECISE-seq reveals disease-relevant TCR repertoires with phenotypic plasticity 的研究论文。该研究开发了一种名为PRECISE-seq（proximity labeling for rapid screening of disease-relevant T cell repertoires）的接触依赖性邻近标记测序平台，能够在单细胞水平上同时解析T细胞的抗原特异性、量化TCR功能亲和力并保留其内源表型状态，为深入理解感染和肿瘤中的T细胞免疫应答提供了全新工具。
PRECISE-seq利用靶细胞膜表面表达的Sortase A（SrtA）催化转肽反应，将生物素探针共价转移至邻近T细胞表面的受体肽上。通过化学反应在T细胞表面均匀偶联SrtA酶识别的受体肽（Acceptor Peptide），确保不同表型状态的T细胞具有均一的底物可及性，从根本上避免了因细胞异质性导致的标记偏差。由于SrtA催化反应的空间范围主要局限于免疫突触尺度，标记信号得以富集在发生抗原识别的T细胞–靶细胞接触界面，从而大幅降低了非特异性背景。研究团队从特异性、灵敏度和定量能力三个维度对该技术进行了系统验证。在特异性层面，CD40-CD40L识别体系与1G4-TCR/NY-ESO-1抗原识别体系均表明，标记信号高度富集于发生同源相互作用的细胞对。在灵敏度层面，OT-I T细胞模型显示，即使抗原特异性T细胞的比例低至万分之一，PRECISE-seq仍可实现稳定检测。在此基础上，研究者进一步利用梯度亲和力的变异肽配体体系，证实标记强度能够定量反映TCR-pMHC相互作用的强弱，从而为在生理条件下评估TCR功能亲和力提供了可行方案。
研究团队首先将PRECISE-seq应用于人巨细胞病毒（CMV）感染模型。从CMV血清阳性供体的外周血中，该方法成功鉴定出6个高置信度的CMV pp65特异性TCR克隆型，其中部分克隆型本底频率极低（低至0.0012%），难以通过常规单细胞TCR测序检出。这一结果在独立批次中可稳定重现，并在另外两名携带不同HLA等位基因的供体中同样得到验证，标记信号与平行pMHC四聚体染色高度吻合，证实了该方法跨个体、跨HLA背景的普适性。功能激活筛选进一步确认了四个高置信度克隆型的CMV反应性，且PRECISE-seq赋予的亲和力评分与体外EC50测定高度一致。转录组分析则揭示，CMV特异性T细胞主要富集于效应记忆亚群，高亲和力克隆型优先表现出耗竭表型，与反复抗原刺激驱动耗竭的既有认知相符。这些结果表明，PRECISE-seq能够在单一实验中同时获取抗原特异性、TCR亲和力与转录表型信息，实现对病毒特异性T细胞应答的全景刻画。
在肿瘤免疫领域，研究者将PRECISE-seq应用于MC38结肠癌小鼠模型，系统解析了肿瘤微环境中多克隆肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的表型动态及其对PD-1阻断治疗的响应。在未治疗的肿瘤中，肿瘤特异性T细胞除分化为经典的耗竭T细胞（TEX）外，还大量富集于一群表达抑制性杀伤细胞凝集素样受体的Ly49⁺ CD8⁺ T细胞（TLy49）。TLy49细胞具有独特的转录特征——高表达Ly49家族受体（Klra3、Klra5）、FcεRIg、转录因子Helios以及免疫抑制分子SPP1，而IFN-γ等效应细胞因子的表达则显著低于常规效应T细胞。功能实验表明，TLy49能够诱导效应T细胞死亡并抑制其增殖；体内过继转移实验则直接证明TLy49促进肿瘤生长，确认了其免疫抑制功能。谱系分析表明，TLy49起源于效应记忆T细胞（TEM），沿一条独立于经典耗竭的分化轨迹发育，具有多样化的TCR库组成，提示其识别广谱的肿瘤抗原。
值得注意的是，PD-1阻断治疗显著改变了肿瘤特异性T细胞的分化命运：治疗后TLy49的比例和绝对数量均大幅减少，而效应性TEM和TEFF细胞显著扩增，提示αPD-1治疗通过抑制TLy49的分化、促进效应状态的转换来发挥抗肿瘤作用。这一从TLy49调控状态向效应状态的表型转换在多个人类临床队列中得到验证。研究团队分析了错配修复缺陷型结直肠癌、肝细胞癌和黑色素瘤患者在接受PD-1阻断治疗前后的单细胞转录组数据，发现TEM/TEFF与TLy49的比值在免疫治疗应答者中显著升高，而非应答者的该比值保持偏低水平。在黑色素瘤队列中，治疗前该比值即可预测患者预后（log-rank P = 0.0056），提示TEM/TEFF与T Ly49比值有望作为预测PD-1阻断治疗疗效的潜在生物标志物。
综上所述，该研究建立的PRECISE-seq技术实现了在单细胞层面同时解析TCR抗原特异性、功能亲和力和内源表型状态的多维度整合分析。通过这一技术，研究团队揭示了肿瘤特异性T细胞优先分化为具有免疫抑制功能的TLy49状态这一新现象，并阐明了PD-1阻断治疗通过促进T细胞由TLy49向效应状态转换来发挥抗肿瘤作用的新模式。这些发现为理解免疫检查点阻断如何重塑肿瘤内T细胞命运提供了重要见解，也为基于TCR的个体化免疫治疗策略优化开辟了新方向。
清华大学徐萌教授和北京大学陈鹏教授为本文共同通讯作者。北京大学/清华大学刘士博博士、国家生物信息中心梁广豪博士、清华大学研究生杨雅云和时䶮洋，以及国家生物信息中心董丽辉博士为本文共同第一作者。清华大学林欣教授和潘登教授为本研究提供了关键实验材料，清华大学动物设施的常在博士为动物实验提供了重要支持。北京大学林锋和曹宇辉为化学反应的设计与优化做出了重要贡献。纽约大学王俊教授和国家生物信息中心韩大力研究员为技术优化和数据分析提供了重要建议。
原文链接：https://rupress.org/jem/article/223/6/e20251779/282549/PRECISE-seq-reveals-disease-relevant-TCR
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