2021年3月12日，清华大学医学院丁强课题组在《PLOS Pathogens》杂志上在线发表题为《一种模拟新冠病毒生命周期的新型细胞培养系统》（A novel cell culture system modeling the SARS-CoV-2 life cycle）的研究论文。该论文首次报道了以核衣壳蛋白反式互补为基础的SARS-CoV-2遗传学操作系统，使得对SARS-CoV-2的研究可以在生物安全等级二级（BSL-2）实验室进行，为病毒学基础研究、药物筛选、中和抗体检测和疫苗评价提供了有力工具。
SARS-CoV-2的爆发严重影响了人们的生产和生活，并夺走了很多人的生命。现在虽然有紧急批准使用的疫苗，但治疗新冠肺炎的特效药还有待开发。特别是病毒突变株（例如英国株、南非株和巴西株等）的出现，使得现存疫苗的有效性需要进一步评估。SARS-CoV-2需要在生物安全等级三级（BSL-3）实验室进行研究，然而BSL-3实验室数量有限，这就阻碍了对SARS-CoV-2的基础病毒学研究以及抗病毒药物的开发。
SARS-CoV-2的核衣壳（N）蛋白是病毒颗粒组装必需的结构蛋白。在本论文中，研究人员将SARS-CoV-2基因组中的N基因删除，并替换成报告基因（此处为绿色荧光蛋白GFP），将SARS-CoV-2 GFP/del N的cDNA分A-E五个DNA片段扩增（其中A片段上游为T7启动子），酶切后体外连接，利用T7聚合酶体外转录得到SARS-CoV-2 GFP/delN基因组RNA。研究人员将该RNA转染到病毒包装细胞系(利用慢病毒转导方法，制备稳定表达病毒N蛋白的人来源的Caco-2细胞，命名为Caco-2-N细胞)后，即可产生出N基因缺失的重组病毒。此重组病毒仅可以在表达病毒N蛋白的细胞中完成生命周期，保证了系统的安全性，该实验体系命名为SARS-CoV-2 GFP/delN VLP（病毒样颗粒）系统（图1）。研究人员将SARS-CoV-2 GFP/delN VLP连续传代一个月后，通过深度测序没有检测到N基因重组到病毒基因组上，说明了该系统的安全性。为了进一步提高系统的安全性，研究人员利用蛋白质反式剪切技术（Intein）将N的cDNA拆成2部分，分别和Intein的N端和C端连接，在两个独立载体中表达，进一步降低了N基因和病毒基因组重组的可能。表达后产生的2个蛋白在intein的介导下重组成全长的病毒N蛋白，发挥其功能。该系统产生的病毒样颗粒的感染能力可被新冠中和抗体、可溶性ACE2、干扰素、瑞德西韦以及GC376 (SARS-CoV-2蛋白酶抑制剂)所抑制。该系统为研究N蛋白的功能提供了便利，研究人员发现SARS-CoV的N蛋白在功能上跟SARS-CoV-2的N蛋白相似，而MERS-CoV的N蛋白则差异较大，为我们理解冠状病毒的亲缘关系提供了重要依据；同时，研究人员利用该系统，发现N蛋白特定位点（S188和S206）的磷酸化修饰对N蛋白发挥功能至关重要。最后，研究人员利用该系统建立了药物高通量筛选平台，从约400种化合物中找到了5种能够高效抑制SARS-CoV-2重组病毒感染的化合物，并在真病毒感染情况下验证了其效果。
除此之外，丁强课题组与清华大学生命科学学院张强锋课题组合作，利用SARS-CoV-2 GFP/delN VLP系统证明了SARS-CoV-2基因组RNA二级结构的重要功能，并且筛选到了靶向宿主蛋白的抗病毒药物1；丁强课题组还与上海科技大学黄行许课题组合作，利用SARS-CoV-2反式互补系统，证明病毒核衣壳N蛋白可以跟宿主G3BP蛋白发生相变，从而解聚应激颗粒，促进病毒感染2。目前，丁强课题组正在和清华以及其他科研单位的课题组进行合作，利用该系统开展创新药物发现以及病毒和宿主相互作用的研究。
综上所述，SARS-CoV-2 GFP/delN VLP为研究SARS-CoV-2基础病毒学，解析病毒与宿主相互作用，评价抗病毒药物和中和抗体效果以及新药开发提供了重要的研究工具（图1）。
清华大学医学院博士生鞠晓辉为该论文的第一作者，复旦大学朱云凯、王玉燕和清华大学张佳星、龚明丽、任文琳等参与了此工作，论文的其他作者还包括巴斯德研究所钟劲教授、清华大学医学院张林琦教授、清华大学生命科学学院李赛研究员和张强锋研究员。中国农业大学李景睿副教授和复旦大学张荣研究员对该研究做出了重要贡献，清华大学医学院丁强研究员为论文的通讯作者。该研究由北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、清华大学自主科研计划以及清华大学高精尖中心等资助完成。
论文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1009439
参考文献：
1.Sun L*, Li P*, Ju X*, Rao, J*, Huang, W*, et al. In vivo structural characterization of the SARS-CoV-2 RNA genome identifies host proteins vulnerable to repurposed drugs. Cell, 2021. (* co-first author)
2.Luo L*, Li Z*, Zhao T*, Ju X*, et al. SARS-CoV-2 nucleocapsid protein phase separates with G3BPs to disassemble stress granules and facilitate viral production. Science Bulletin, 2021. (* co-first author)
