组蛋白翻译后修饰在一系列染色质活动中扮演着极为重要的角色，也是调控表观遗传学事件的重要机制之一。在细胞内，组蛋白翻译后修饰受到其“书写器”（“Writer”）和“擦除器”（“Eraser”）的严密调节，并且通过招募其“阅读器”（“Reader”）效应蛋白来调控染色质结构及相关基因表达，从而影响DNA复制、细胞分裂、分化和凋亡等关键细胞进程。越来越多证据表明，组蛋白修饰失调与识别紊乱是一些人类疾病如癌症的重要发病原因之一，这也使得组蛋白修饰相关蛋白成为了近年来表观遗传学药物研发的热门靶点。在所有组蛋白修饰中，赖氨酸乙酰化（Kac）是最早发现也是被研究得最充分的修饰之一。一些靶向组蛋白乙酰化“阅读器”——溴域（Bromodomain）的抑制剂甚至已经进入了临床实验阶段。
2018年10月29日，清华大学医学院李海涛研究团队与香港大学李祥课题组联合在Nature Chemical Biology杂志发表题为Structure-guided development of YEATS domain inhibitors by targeting π-π-π stacking的研究成果，首次报道了一类靶向AF9和ENL YEATS结构域的高效、特异性抑制剂，并证明其中一个选择性靶向ENL YEATS的抑制剂具有细胞膜通透性并可以和（+）-JQ1协同作用降低白血病细胞中的相关致癌基因的表达。
YEATS结构域是2014年由美国MD安德森癌症中心石晓冰实验室与清华大学李海涛课题组合作鉴定出的新型组蛋白乙酰化“阅读器”（Li Y et al，Cell 159:558-571）。2016年，李海涛课题组又发现YEATS结构域能够以更强的亲和力识别组蛋白巴豆酰化（Kcr）并调控相关基因表达 （Li Y et al, Mol Cell 62:181-193； Zhao D et al，Cell Res 26:629-632）。人类基因组共编码4种含有YEATS结构域的蛋白，分别是ENL、AF9、YEATS2和GAS41，其中ENL和AF9的YEATS结构域具有很高的序列相似性。2017年，李海涛课题组又与合作团队石晓冰实验室、美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心Scott A. Armstrong实验室、洛克菲勒大学C. David Allis实验室，在Nature杂志发表论文，阐明了ENL的YEATS结构域通过识别组蛋白乙酰化，招募相关蛋白复合体上调致癌靶基因的表达，从而导致并维持急性白血病的分子机理；而与ENL高度相似的AF9却在此过程中并无重要作用（Wan L， Wen H, Li Y et al, Nature 543:265-269）。值得注意的是，在白血病细胞中敲除ENL可以和著名的溴域抑制剂（+）-JQ1起到协同作用，进一步抑制癌细胞增长并增加白血病小鼠的存活率。这揭示联合靶向ENL结构域和溴域可以为白血病的治疗提供新的方案，也使得ENL YEATS结构域成为新的潜在药物靶点，因此靶向YEATS结构域抑制剂研发成为领域内的研究热点。
2016年，李海涛研究团队首次发现AF9 YEATS结构域通过p-p-p堆积偏好性地识别组蛋白巴豆酰化的晶体结构（Li Y et al, Mol Cell 62:181-193）。受此启发，香港大学李祥课题组首先将AF9 YEATS结构域识别位点（H3K9cr）的巴豆酰基团替换为其他具有更大共轭体系的基团，得到了一系列基于组蛋白H3（4-13）序列的十肽。利用竞争性光交联实验方法对这些十肽进行检测，发现将巴豆酰基团替换为2-呋喃甲酰基或5-噁唑甲酰基会很大地（4-10倍）增强AF9 YEATS结构域对多肽的亲和性。作者进一步对多肽的长度及序列进行了一系列优化，最终得到了两个高效的亚微摩级五肽抑制剂XL-07i和XL-13a（IC50分别为0.26 mM和0.24 mM，AF9天然多肽底物IC50为6.0 mM）。
李海涛研究团队解析了AF9 YEATS结构域和五肽抑制剂XL-07i相互作用复合物的高分辨率晶体结构（分辨率为1.9埃），发现其YEATS结构域通过保守的三明治芳香笼口袋（S58、F59、Y78）实现对位于组蛋白H3多肽K9位2-呋喃甲酰基(2-furancarbonyl)侧链的精准识别。值得一提的是，与天然底物巴豆酰基团相比，一系列水分子参与介导的氢键作用网络增强了抑制剂XL-07i与AF9 YEATS之间的亲和力。五肽抑制剂N端苄氧甲酰化（Cbz）侧链则与AF9 YEATS的H107与H111的咪唑环形成了特殊的p堆积结构，进一步增强了二者相互作用。进一步研究发现XL-07i和XL-13a特异性地抑制AF9和ENL，相对而言对另外两种YEATS结构域蛋白YEATS2和GAS41的抑制作用很弱。因为之前报道证明是ENL而不是AF9的YEATS结构域对急性白血病的发生及维持非常重要，所以作者试图开发出特异性靶向ENL YEATS结构域的抑制剂，而ENL和AF9高度的序列相似性使得这一工作并不容易。作者从ENL和AF9的YEATS结构域具有不同的天然识别序列（ENL偏好性识别H3K27cr而不是H3K9cr）入手，通过改变5-噁唑甲酰基赖氨酸周围的氨基酸序列，从众多候选分子中筛选出了两个选择性抑制ENL的抑制剂XL-13m（IC50 = 0.56 mM）和XL-13n（IC50 = 0.28 mM），其对AF9的抑制作用分别弱了4.5和6.1倍。利用活细胞内热稳定性迁移技术（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA），作者证明了在三种不同的白血病细胞系（MOLM-13、MV4；11和HEL）中，三肽抑制剂XL-13m均可以透过细胞膜，并特异性地靶向细胞内源的ENL而不会作用于内源的AF9蛋白。更加重要的是，ChIP-qPCR和RT-PCR实验表明在MOLM-13细胞系中，XL-13m处理会阻碍ENL和其靶基因（HOXA10、MEIS1、MYB和MYC）的结合并显著性降低这些致癌基因的表达。接下来的研究发现，该ENL抑制剂可以和溴域抑制剂（+）-JQ1或者组蛋白甲基转移酶DOT1L抑制剂EPZ-5676协同作用，增强这两种抑制剂的效用，进一步下调MOLM-13细胞中癌基因的表达水平。
据不完全统计，该论文是首个对YEATS结构域抑制剂的报道，也是首次以p-p-p堆积结构为靶标进行抑制剂的设计，为今后对YEATS结构域抑制剂及治疗白血病新型药物的开发提供了思路，也为研究AF9和ENL在细胞活动中的功能提供了新的工具。
香港大学化学系李祥课题组李歆博士和李晓萌博士为本论文共同第一作者，李祥教授和李海涛研究团队成员清华大学医学院助理研究员李元元博士为本论文共同通讯作者。这项研究也得到了美国洛克菲勒大学C. David Allis实验室、万里玲博士和MD安德森癌症中心石晓冰实验室的大力协作。
本课题得到国家自然科学基金委、科技部国家重点研发计划、北京市结构生物学高精尖创新中心、北京市科技新星计划、中国科协青年人才托举工程等的经费支持。数据收集得到蛋白质凤凰工程和上海同步辐射光源的大力支持与协助。
◎论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41589-018-0144-y
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