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清华刘晓冬研究组《自然•通讯》发文 揭示常用钙离子探针GCaMP副作用的机理并推出新一代无损伤探针GCaMP-X 时间:2018-04-18

2018年4月17日,清华大学医学院生物医学工程系刘晓冬研究组在《自然•通讯》(Nature Communications)期刊在线发表了题为“改进版钙离子探针GCaMP-X克服了GCaMP中钙调素对钙离子通道的影响”(Improved Calcium Sensor GCaMP-X Overcomes the Calcium Channel Perturbations Induced by the Calmodulin in GCaMP)的研究长文(Research Article)。针对目前广泛应用的基因编码型钙离子探针GCaMP,刘晓冬研究组首次揭示了GCaMP导致神经元异常及损伤的机理,并据此开发了克服这些弊端的新一代探针GCaMP-X。


该项研究指出GCaMP中关键组件—钙调素(Calmodulin,CaM)严重干扰了L型电压门控钙通道介导的兴奋-转录耦联,使得神经元的钙动态以及基因表达均出现异常。以克服“非钙结合态钙调素”(apoCaM)的干扰为突破口,刘晓冬研究组在探针中引入特异性apoCaM保护元件,成功消除了GCaMP所有已知的“副作用”。新一代GCaMP-X有助于实现安全无损、长时程、多细胞器的定量钙信号监测,也为基于钙调素的多种分子工具提供了新的设计准则。


刘晓冬研究员为论文的通讯作者,实验室博士生杨亚雄、刘楠及何元源为论文的共同第一作者,论文的作者还包括博士生刘玉霞、葛琳和邹林志,以及清华大学医学院宋森研究员和生命科学学院熊巍研究员。此项工作的完成得到了清华大学贾宜昌、苑克鑫、姚骏、杜亚楠等实验室的大力协助。


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无损伤GCaMP-X与传统GCaMP比较示意图


传统GCaMP探针(对应上图灰色蛋白结构)如同未经点化的石猴,手执金箍棒(钙调素calmodulin)大闹天宫(神经元,以南天门比拟钙通道),导致神经元状态异常;新型GCaMP-X利用钙调素保护元件(对应下图中黄色加亮结构域)消除了GCaMP在神经元中的异常行为(好比在紧箍咒制约下的孙悟空和金箍棒)。


细胞需要钙离子维系正常的生命活动而钙失调(如钙超载等)则会导致多种疾病,因此在生物医药研究中经常需要对生命体的钙信号进行精准监测。GCaMP是在神经科学等多个领域中应用最为广泛的基因编码钙离子探针,但传统GCaMP探针存在严重弊端:在长时程和(或)高表达时会引起神经元状态异常,具体表现为GCaMP异常进入细胞核并聚集、神经元钙响应异常、神经元损伤并凋亡等。不仅限于质粒转染和病毒侵染等探针导入方式,以往被认为副作用微弱的GCaMP转基因小鼠近期也在多个品系中发现癫痫等问题。此类问题严重影响了实验结果的可信度和GCaMP进一步的推广应用,但由于GCaMP影响神经元的机理不明,尽管自早期流行版本GCaMP3起就被发现有副作用,但这一瓶颈问题直至当前最新版本GCaMP6仍未得到解决。刘晓冬研究组从GCaMP的设计原理入手,通过实验证实了GCaMP中钙离子响应元件钙调素是引起神经元异常的关键原因。钙调素广泛表达在各类细胞中,是最为重要的钙离子感受器和钙信号蛋白;在神经元中,介导兴奋-转录耦联的L型电压门控钙通道也处于钙调素蛋白(包括钙结合和非结合两种状态)的精密调控之下。作者发现,GCaMP表达神经元L型电压门控钙通道(CaV1.3)的门控被异常增强,相关钙内流增加,可导致神经元发育异常。与此同时,GCaMP异常结合到CaV1.3通道上严重干扰正常钙调素的核迁移过程。长时程表达时,GCaMP出现异常核聚集,干扰下游基因转录因子CREB通路的正常运转,最终引发神经元退化和凋亡。据此,作者在GCaMP氮端引入能够特异结合apoCaM的保护元件,所实现的新型探针GCaMP-X不仅有效阻止了GCaMP对钙通道和神经元的干扰,还依然保留了GCaMP优良的钙动态监测特性。作者进一步在GCaMP碳端加入细胞定位序列:如测量近膜局域钙信号的GCaMP-XM探针,以及特异性定位于细胞核的GCaMP-XN探针,以满足不同实验研究,实现钙信号的精准、特异、无损及长时程测量。


除GCaMP之外,钙调素被广泛用于多种分子工具如FRET型钙探针D3cpv、以及神经活动探针CaMPARI等的设计。本项研究提示这些探针的使用中应警惕类似的副作用,GCaMP-X的设计原理也为这一大类探针的改进以及未来新型探针的设计提供了先例和示范。


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新一代钙离子探针GCaMP-X的设计原理


GCaMP钙离子探针在神经元中会同钙通道CaV1.3结合,引起通道门控的异常增强,并进一步引发神经元相关基因表达的异常增强①。与此同时,GCaMP也会干扰CaM正常情况下响应CaV1.3钙信号的核迁移过程,长时程表达时引发GCaMP异常核聚集。入核GCaMP扰乱了转录因子CREB信号通路的正常运转,导致神经元退化和凋亡②。改造后的GCaMP-X有效避免了对钙通道门控的干扰③,钙通道打开—钙离子跨膜进入细胞—钙调素核迁移—转录因子CREB启动,这一兴奋-转录耦联通路得以维系,神经元状态保持正常④。

 

刘晓冬研究组致力于研究钙离子通道及钙信号的工作机理,并研发相关的定量监测方法及新颖干预手段。本论文是实验室继前期工作(《自然》Nature 2010;《细胞•报告》 Cell Reports 2015;《e生命》eLife 2017;《自然•通讯》 Nature Communications 2018等)的最新研究进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所等方面的支持。




论文链接:

https://www.nature.com/articles/s41467-018-03719-6



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